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Microdissection des cellules précurseurs des organes sensoriels

Dissection de notum
Des nota de pupes Neuralized-GAL4 UAS-GFP :: mCD8 sont disséqués dans du PBS froid et fixés dans l’éthanol absolu froid pendant 10 minutes. Trois à cinq nota fixés sont ensuite transférés sur une lame pour microdissection laser avec membrane thermolabile, aplatis soigneusement et séchés, l’épithélium étant tourné vers le bas. Pour améliorer le rendement et la qualité des ARNs, nous disséquons, fixons et montons les nota juste avant la microdissection.

La microdissection laser

La microdissection laser est réalisée sur un système MMI de microdissection CellCut couplé à un microscope inversé à fluorescence Eclipse TE-2000 (Instrument Nikon). Les paramètres utilisés sont les suivants: focus 40, vitesse 1, puissance 74 à l’objectif X60. Les SOP exprimant la GFP ont été découpés par le laser UV suivant un cercle de 9 um de rayon. Nous avons pris soin de laisser un espace entre le cercle laser et la bordure de la cellule pour préserver l’ARN (environ 5 um). Quatre à huit passages du laser sont nécessaires pour découper le notum. Le succès de la capture des cellules est confirmé visuellement par les trous visibles dans le tissu (Figure). Nous collectons environ 20 à 50 cellules sur un bouchon, 20 ul de tampon d’extraction sont déposés directement sur le bouchon du tube, puis le tube est conservée à -80 ° C (bouchon vers le bas). Nous regroupons 20 à 40 tubes afin de procéder à l’extraction des ARNs. Ainsi, nous collectons environ 1000 SOP  pour un échantillon d’ARN.

Extraction d’ARN et amplification
L’ARN total est extrait des cellules prélevées par microdissection en utilisant le kit d’isolement d’ARN PicoPure (Molecular Devices – Arcturus), en suivant les instructions du fabricant avec des modifications mineures, comme décrit ci-dessous. Nous avons incubé les tubes à l’envers contenant les cellules microdisséquées avec 20 ul de tampon d’extraction à 42 ° C pendant 30 min. Puis, après centrifugation, les extraits sont regroupés et passés sur une colonne de purification d’ARN. Lors de la purification, la colonne est traitée avec la DNAse I (Qiagen) pendant 30 min à température ambiante pour éviter toute contamination d’ADN génomique. Nous obtenons 0,1-0,5 μg d’ARN totaux à partir d’un échantillon de 1000 cellules microdisséquées. Après extraction, l’ARN est amplifié en utilisant le kit d’amplification Message AmpII ARNa (Ambion). Nous avons procédé à deux tours (de 9 h chacun) de transcription in vitro. Pour une meilleure intégrité de l’ARN, nous avons réalisé tous les procédés d’amplification en une seule étape, directement après extraction de l’ARN pour éviter de congeler l’échantillon. En effet, en plus des recommandations habituelles concernant la manipulation de l’ARN, nous avons évité, autant que possible, la congélation du tissu avant la microdissection ainsi que celles des échantillons d’ARN entre l’extraction et l’amplification. Après deux tours d’amplification, nous avons obtenu de 20 à 50 μg de ARNc  à partir d’un échantillon de 1000 cellules microdisséquées.